• 氏名
  平塚　正治(Masaharu Hiratsuka)

【略歴】

e-mail:mhiratsu@grape.med.tottori-u.ac.jp

tel:+81-859-38-6412

研究内容 紹介　(ヒト人工染色体を用いた、複雑系遺伝子発現ベクターの構築）

•  ヒト人工染色体を用いた無傷なiPS細胞作製法の開発

1. ヒト人工染色体を用いた高品質で、無傷なiPS細胞作製法の開発

  山中教授により作成方法が確立された人工多能性幹細胞(iPS:Induced Pluripotency Stem)は近未来の再生医療において、移植用細胞を供給する資源として大きな注目を集めています。iPS細胞を作成するためには、レトロウイルスベクターなどを用いて、初期化因子を細胞のゲノムに組み込む必要がありました。しかしながら、この方法は、iPS細胞の持つ本来の遺伝情報を壊してしまうため、細胞は正常な機能を失い、癌化してしまう恐れがありました。そこで私たちは、ヒト人工染色体ベクターの利点である、「宿主染色体に組み込まれずに、遺伝子導入ができる」という点に着目し、宿主細胞の遺伝情報を壊さずに初期化を行うことに成功しました。

  Figure1. ヒト人工染色体を用いた無傷なiPS細胞作製法の概略図

　ヒト人工染色体にiPS細胞を誘導するための初期化因子を搭載し、微小核細胞融合法(Microcell-mediated chromosome transfer:MMCT)により体細胞に染色体導入を行うことで、体細胞の初期化を行います。また、得られたiPS細胞は初期化用ヒト人工染色体を保持しています。この細胞から、ヒト人工染色体のマーカーであるGFP蛍光を目印にフローサイトメトリーにより、ヒト人工染色体の脱落した細胞分画を回収すると同時に、自殺遺伝子の作用により、ヒト人工染色体非保持細胞を濃縮しました。この方法にて、無傷なiPS細胞(HAC-free iPS細胞)は樹立されました。なお、このiPS細胞作製方法は特許出願中です。

Figure2. iPS細胞を誘導するヒト人工染色体(iHAC2)の概略図

 初期化誘導のできる染色体(iHAC2)には、共同研究者である山中教授の発見した4つの因子が搭載されています。すなわち、Klf4, c-Myc, Sox2, Oct4です。Klf4, c-Myc, Sox2については、転写活性を高めるために、CAGプロモーターによる発現ユニットを2ユニットずつ、また、Oct4は特に重要な初期化因子として知られており、これをほかの因子群より高発現させるために、発現ユニットを4ユニット搭載しました。

また、体細胞の時点で発現するP53を抑制することにより、より高い初期化効率が得られるため、上記初期化因子に加え、ヒト人工染色体にはP53抑制性のshRNA発現ユニットを同時に搭載し、体細胞の初期化に成功しました。

研究実績

 (First auther)

1. Hiratsuka M, Uno N, Ueda K, Kurosaki H, Imaoka N, Kazuki K, Ueno E, Akakura Y, Katoh M, Osaki M, Kazuki Y, Nakagawa M, Yamanaka S, Oshimura M. Integration-free iPS cells engineered using human artificial chromosome vectors. PLoS One. 2011;6(10):e25961. Epub 2011 Oct 5.(Pubmed)
2. Hiratsuka M, Inoue T, Toda T, Kimura N, Shirayoshi Y, Kamitani H, Watanabe T, Ohama E, Tahimic CG, Kurimasa A, Oshimura M.         Proteomics-based identification of differentially expressed genes in human gliomas: down-regulation of SIRT2 gene.Biochem Biophys Res Commun. 2003 Sep 26;309(3):558-66.(Pubmed)

(Co-auther)

1.  Kakeda M, Nagata K, Osawa K, Matsuno H, Hiratsuka M, Sano A, Okazaki A, Shitara S, Nishikawa S, Masuya A, Hata T, Wako S, Osaki M, Kazuki Y, Oshimura M, Tomizuka K.
   A new chromosome 14-based human artificial chromosome (HAC) vector system for efficient transgene expression in human primary cells.Biochem Biophys Res Commun. 2011 Nov 25;415(3):439-44. Epub 2011 Oct 22.(Pubmed)
2. Kurosaki H, Hiratsuka M, Imaoka N, Iida Y, Uno N, Kazuki Y, Ishihara C, Yakura Y, Mimuro J, Sakata Y, Takeya H, Oshimura M.
   Integration-free and stable expression of FVIII using a human artificial chromosome.
   J Hum Genet. 2011 Oct;56(10):727-33. doi: 10.1038/jhg.2011.88. Epub 2011 Aug 11.(Pubmed)
3. Kazuki Y, Hiratsuka M, Takiguchi M, Osaki M, Kajitani N, Hoshiya H, Hiramatsu K, Yoshino T, Kazuki K, Ishihara C, Takehara S, Higaki K, Nakagawa M, Takahashi K, Yamanaka S, Oshimura M.
   Complete genetic correction of ips cells from Duchenne muscular dystrophy.
   Mol Ther. 2010 Feb;18(2):386-93. Epub 2009 Dec 8.(Pubmed)
4. Kinoshita Y, Kamitani H, Mamun MH, Wasita B, Kazuki Y, Hiratsuka M, Oshimura M, Watanabe T.
   A gene delivery system with a human artificial chromosome vector based on migration of mesenchymal stem cells towards human glioblastoma HTB14 cells.
   Neurol Res. 2010 May;32(4):429-37. Epub 2009 Jul 8.(Pubmed)
5. Inoue T, Nakayama Y, Yamada H, Li YC, Yamaguchi S, Osaki M, Kurimasa A, Hiratsuka M, Katoh M, Oshimura M.
   SIRT2 downregulation confers resistance to microtubule inhibitors by prolonging chronic mitotic arrest.
   Cell Cycle. 2009 Apr 15;8(8):1279-91. Epub 2009 Apr 19.(Pubmed)
6. Shitara S, Kakeda M, Nagata K, Hiratsuka M, Sano A, Osawa K, Okazaki A, Katoh M, Kazuki Y, Oshimura M, Tomizuka K.
   Telomerase-mediated life-span extension of human primary fibroblasts by human artificial chromosome (HAC) vector.
   Biochem Biophys Res Commun. 2008 May 9;369(3):807-11. Epub 2008 Mar 5.(Pubmed)
7. Inoue T, Hiratsuka M, Osaki M, Oshimura M.
   The molecular biology of mammalian SIRT proteins: SIRT2 in cell cycle regulation.
   Cell Cycle. 2007 May 2;6(9):1011-8. Epub 2007 May 30. Review.(Pubmed)
8. Kurosaki H, Kazuki Y, Hiratsuka M, Inoue T, Matsui Y, Wang CC, Kanatsu-Shinohara M, Shinohara T, Toda T, Oshimura M.
   A comparison study in the proteomic signatures of multipotent germline stem cells, embryonic stem cells, and germline stem cells.
   Biochem Biophys Res Commun. 2007 Feb 9;353(2):259-67. Epub 2006 Dec 13.(Pubmed)
9. Suda T, Katoh M, Hiratsuka M, Takiguchi M, Kazuki Y, Inoue T, Oshimura M.
   Heat-regulated production and secretion of insulin from a human artificial chromosome vector.
   Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 24;340(4):1053-61. Epub 2005 Dec 27.(Pubmed)
10. Nishigaki R, Osaki M, Hiratsuka M, Toda T, Murakami K, Jeang KT, Ito H, Inoue T, Oshimura M.
    Proteomic identification of differentially-expressed genes in human gastric carcinomas.
    Proteomics. 2005 Aug;5(12):3205-13.(Pubmed)
11. Ishigami A, Ohsawa T, Hiratsuka M, Taguchi H, Kobayashi S, Saito Y, Murayama S, Asaga H, Toda T, Kimura N, Maruyama N.
    Abnormal accumulation of citrullinated proteins catalyzed by peptidylarginine deiminase in hippocampal extracts from patients with Alzheimer's disease.
    J Neurosci Res. 2005 Apr 1;80(1):120-8.(Pubmed)
12. Kamino H, Hiratsuka M, Toda T, Nishigaki R, Osaki M, Ito H, Inoue T, Oshimura M.
    Searching for genes involved in arteriosclerosis: proteomic analysis of cultured human umbilical vein endothelial cells undergoing replicative senescence.
    Cell Struct Funct. 2003 Dec;28(6):495-503.(Pubmed)
13. Suda T, Katoh M, Hiratsuka M, Fujiwara M, Irizawa Y, Oshimura M.
    Use of real-time RT-PCR for the detection of allelic expression of an imprinted gene.
    Int J Mol Med. 2003 Aug;12(2):243-6.(Pubmed)